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饲用金属蛋白酶的研究和应用(一)

发布时间:2014-05-06 14:42:00 点击:

饲用金属蛋白酶的研究和应用(一)

北京金英赛得科技有限公司/张泽虎/关静姝/王达

1 引言

蛋白水解酶(protease)可分为内肽酶(endopeptidase)和外肽酶(exopeptidase) 两大类。内肽酶根据其活性基团类型一般可分为5类,即:丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)、半胱氨酸蛋白酶(EC3.4.22)、天门冬氨酸蛋白酶(EC 3.4.23)、苏氨酸蛋白酶(EC 3.4.25) 和金属蛋白酶(EC 3.4.24)[1]

在自然界中,金属蛋白酶主要存在于动物体内或由微生物分泌,伍久林等[2]2008)从鲤鱼(Cyprinus carpio)肌肉中分离纯化到一种金属蛋白酶,史劲松等[3]2006)报道冰川耐冷菌(Bacillus cereus SYP-A2-3)可分泌冷适性金属蛋白酶。目前的研究表明,金属蛋白酶除了对蛋白质具有比较强的分解能力外,还对温度、pH值以及高金属离子浓度环境具有较强的耐受力[2-4]。因此,金属蛋白酶作为饲料添加剂在养殖动物上应用具有很大的优势。但由于目前在该领域金属蛋白酶的研究报道并不多,因此,笔者将结合源自蜘蛛肠道内共生微生物HY-3所分泌的金属蛋白酶——蜘蛛酶(Arazyme®),对此类酶制剂的特性进行介绍。

2 金属蛋白酶的定义及特性

2.1金属蛋白酶(Metalloprotease)的定义

活性中心中含有金属离子的蛋白水解酶的总称。在这类酶中,金属离子被氨基酸残基紧密地结合在一起,构成活性中心,这个金属离子对于酶活性是很重要的。对于不同的金属蛋白酶,其包含的金属离子也有所不同,主要是Ca2+Zn2+。一些金属蛋白酶以及所包含的金属离子见表1

1 金属蛋白酶及所包含的金属离子

金属蛋白酶

所包含的金属离子

羧肽酶A

Zn2+

羧肽酶B

Zn2+

胶原酶

Ca2+Zn2+

热溶素

Zn2+

蜘蛛酶

Zn2+

2.2 金属蛋白酶的特性

2.2.1 金属蛋白酶的催化机制依赖于含金属离子的活化中心

金属蛋白酶主要是一类Zn2+依赖性的蛋白水解酶,其活性中心除金属离子外,还需要其他氨基酸残基参与。未活化的金属蛋白酶在前肽上有半胱氨酸通过配位键与Zn2+相连,激活时此键打开,其活化方式有以下几种途径:(1)氨基酸残基被金属离子、疏基试剂或氧化剂作用或修饰;(2)受促溶剂(KI)和去垢剂(SDS)作用而引起多肽改变;(3)被丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶裂解,失去一小分子肽段;(4)自身激活[5]


1 金属离子对蜘蛛酶相对酶活性的影响

1显示的是金属离子(Zn2+Fe2+Mn2+Ca2+Mg2+Cu2+Co2+)对蜘蛛酶相对酶活性的影响,其中Zn2+对蜘蛛酶活性的影响最大,在5mM Zn2+时蜘蛛酶的相对活性是无Zn2+存在时的4倍,而其他的几种金属离子也都不同程度的激活了蜘蛛酶的活性;虽然当Cu2+的浓度达到10mM时,蜘蛛酶相对酶活出现下降,但是也维持在原酶活性(100%)。

由于饲料中含有矿物质添加剂,通常情况下仔猪日粮中铜和锌的需要量为6mg/kg100mg/kgNRC,1998),但是作为高铜使用时,铜的含量会达到125-250 mg/kg[8],仔猪断奶后前两周配合饲料中氧化锌形式的锌允许添加量≤3000mg/kg(中华人民共和国农业行业标准NY-929-2005),因此,饲用酶制剂是否能够耐受金属离子是评价其能否在饲料中添加使用的重要指标之一。

2.2.2 金属蛋白酶的抑制剂

金属蛋白酶含有定量的金属离子,用一般方法是不能将其除去的。但是如果加入EDTA等抑制剂,就会使其因失去金属离子从而失去酶活性,只有再将这种离子加入才能恢复酶活性。表2显示的是几种主要的蛋白酶抑制剂对蜘蛛酶活性的影响,其中2 mM邻二氮杂菲完全抑制了蜘蛛酶的活性,10 mM EDTA抑制了58%的酶活性,而其它几种抑制剂的抑制作用不明显[4]

2 几种主要的蛋白酶抑制剂对蜘蛛酶活性的影响

抑制剂

浓度

保留酶活(%

金属蛋白酶抑制剂EDTA (mM)

10

42

邻二氮杂菲(mM)

2

0

胃蛋白酶抑制剂(uM

1.5

100

丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSFuM

500

81

碘乙酰胺(uM

100

72

半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64uM

5.6

91

TLCKuM

50

100

TPCKuM

50

100

卡托普利(uM

1

82

2.2.3温度对金属蛋白酶活性的影响

温度是影响酶促反应速率的重要因素之一,不同来源的金属蛋白酶对温度的耐受能力也是不同的。从鲤鱼肌肉中纯化得到的金属蛋白酶活性温度范围为30-50[2];来源于草鱼肌肉的金属蛋白酶最适温度为40[6];而来源于微生物的金属蛋白酶其对温度的耐受性更强,国内学者发现冰川耐冷菌Bacillus cereus SYP-A2-3,简称BCP)分泌的金属蛋白酶最适催化温度为40℃,在20-30℃的温度条件下也保持较高的催化活性,甚至在0℃仍有6%相对活力[3]。因为酶是蛋白质,所以大部分的酶在60℃以上变性,但是仍有少数的酶可以耐受较高的温度,例如细菌淀粉酶在93℃下活力最高[7],源自蜘蛛共生微生物HY-3所分泌的金属蛋白酶——蜘蛛酶在90℃的相对酶活仍有80%(见图2)。

2 温度对蜘蛛酶相对酶活性的影响

2.2.4 pH值对金属蛋白酶活性的影响

酶的活力也受环境pH值的影响。在一定pH下,酶的反应具有最大速度,通常称此pH为酶反应的最适pH。目前,从两种淡水鱼类体内分离出的两种金属蛋白酶的最适pH值在7.5-8.0之间[26],冰川耐冷菌BCP的最适pH7.0-8.5[3],蜘蛛酶的最适pH值为8(见图3)。但是最适pH有时会因底物种类、浓度和缓冲液成分不同而不同。例如,胰蛋白酶在以苯甲酰精氨酰胺为底物时,最适pH7.7,而底物换成苯甲酰精氨酸甲酯时的最适pH则降低为7.0[7]。因此,酶的最适pH值并不是一个常数,只有在一定的条件下才有意义。

3 pH对蜘蛛酶相对酶活性的影响

由于动物消化道食糜的pH值变化范围较大,因此仅从最适pH值条件下酶活来评价饲用酶的性能并不客观,陆文清建议应该在一个广泛的pH值范围内来比较饲用酶制剂的酶活性[9]。对蜘蛛酶的研究结果显示:这一金属蛋白酶在4.5-12.0这样一个宽的pH值范围内,酶活始终保持在70%以上。

2.2.5金属蛋白酶对底物的专一性

蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶,虽然都水解肽键,但是其专一性却并不相同。羧肽酶A水解带有芳香族氨基酸的羧基端肽键;源自草鱼肌肉的金属蛋白酶对疏水氨基酸残基具有较高的特异性[6];蜘蛛酶对底物有着广泛的专一性,它主要水解19种氨基酸羧基端形成的肽键,并优先水解甘氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸羧基端形成的肽键[4]。研究还发现蜘蛛酶具有一定的消炎作用[10],而在对蜘蛛酶的消炎机理的研究过程中,Bersanetti 等(2005)发现:蜘蛛酶能够有效的水解炎症介质——缓激肽中甘氨酸-苯丙氨酸之间的肽键;并对缓激肽形成前体——缓激肽原,在其赖氨酸-精氨酸、精氨酸-丝氨酸这两处的肽键进行水解。

在对蜘蛛酶底物的体外试验in vitro中,以牛血清清蛋白为标准,蜘蛛酶对鸡蛋清蛋白和酪蛋白的降解率分别达到100%63%,对胶原质、弹性蛋白、角蛋白、凝胶、血色素的分解能力也超过40%(内部资料)

在饲料配方中,蛋白质原料在配方成本中占有很大比重,尤其是近些年几种主要的蛋白原料价格的上涨,使得配方师不断对配方进行调整——减少高价位蛋白原料(主要是消化吸收率较高的鱼粉、豆粕等)的组成,增加消化吸收性能不佳杂粕的使用量,因此,在这种情况下,应该添加适宜的蛋白酶制剂辅助动物体内的内源酶对杂粕进行分解,以提高机体对其消化吸收利用率。

朴美子等(2004内部资料)研究了蜘蛛酶对动物性饲料蛋白原料——肉粉、智利鱼粉、禽肉粉等,以及植物性饲料蛋白原料——豆粕、棉籽粕、菜籽粕、玉米蛋白粉等的水解程度, 发现添加0.1%( w/v)蜘蛛酶,在37下水解程6小时,经过处理的动物性饲料的水解程度是无添加酶组的2-3倍;经过蜘蛛酶处理的豆粕、棉籽粕、菜籽粕、玉米蛋白粉的水解程度分别是无添加酶组的2.483.531.888.85倍。观察上述结果可以判断蜘蛛酶 (金属性蛋白酶)能有效地分解动物性蛋白和植物性蛋白, 适合作为饲料添加剂使用。

关于“饲用金属蛋白酶在各种动物中的应用的综述”将在下期中进行介绍,敬请关注。

参考文献

[1]王晓媛,陈晨,赵江哲等。暗诱导衰老小麦叶片内一种耐热蛋白水解酶的分离及其生化特性鉴定,南京农业大学学报200730(4)35-39

[2]伍久林,卢宝驹,杜明华等。鲤鱼红色肉中金属蛋白酶的分离纯化与性质分析,集美大学学报(自然科学版),2008134):289-294

[3]史劲松,许正宏,吴奇凡等。冰川环境耐冷菌的冷适蛋白酶分离纯化及酶学性质,应用与环境生物学报,2006121):72-75

[4]Patrícia A. BersanettiHo-Yong ParkKyung Sook Baeet. al.. Characterization of arazyme, an exocellular metalloprotease isolated from Serratia proteamaculans culture medium, Enzyme and Microbial Technology, 2005 (37): 574–581

[5]李成章,任铁冠。基质金属蛋白酶家族。口腔医学纵横,1998141):50-53

[6]刘冰心,曹敏杰,蔡秋凤等。草鱼肌肉亮氨酸氨肽酶的分离纯化与性质研究,集美大学学报(自然科学版),2008131):24-29

[7]沈同,王镜岩。生物化学(上册)。北京:高等教育出版社,1990253-255

[8]和小明,孙安权,赵蕾。应用有机微量元素减少养殖业对环境的污染,新饲料,2009333-36

[9]陆文清。评价饲料酶质量的几种指标,酶制剂在饲料工业中的应用,2005431-434

[10]刘大程,程艳,卢德勋等。高活性生物蛋白酶(POWER-CELL)对患隐性乳房炎奶牛生产性能的影响,中国畜牧兽医,2007347:81-83

 

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